包涵體：在某些生長(zhǎng)條件下，基因工程菌能積累某種特殊的生物大分子，它們致密地集聚在細(xì)胞內(nèi)，或被膜包裹或形成無膜裸露結(jié)構(gòu)，這種水不溶性的結(jié)構(gòu)稱為包涵體。（Inclusion Bodies，IB）。

包涵體的組成及特性

一般含有50%以上的重組蛋白，其余為核糖體元件、RNA聚合酶、外膜蛋白等，環(huán)狀或缺口的質(zhì)粒DNA，以及脂體、脂多糖等，大小為0.5-1um，難溶與水，只溶于變性劑如尿素、鹽酸胍等。
包涵體與蛋白種類及表達(dá)系統(tǒng)無關(guān)，僅為蛋白過量表達(dá)的結(jié)果。

包涵體形成的主要原因

1、表達(dá)量過高：原因可能是合成速度太快，以至于沒有足夠的時(shí)間進(jìn)行折疊，二硫鍵不能完全正確的配對(duì)，過多的蛋白間的非特異性結(jié)合，蛋白質(zhì)無法達(dá)到足夠的溶解度等。       

2、重組蛋白的氨基酸組成：一般說含硫氨基酸越多越易形成包涵體 

3、重組蛋白所處的環(huán)境：發(fā)酵溫度高（37-42℃）或胞內(nèi)pH接近蛋白的等電點(diǎn)時(shí)容易形成包涵體。
4、重組蛋白是大腸桿菌的異源蛋白，由于缺乏真核生物中翻譯后修飾所需酶類，致使中間體大量積累，容易形成包涵體沉淀。采用共表達(dá)分子伴侶的方法以增加可溶蛋白的比例。

分離純化細(xì)菌包涵體蛋白質(zhì)的基本步驟

                   蛋白質(zhì)產(chǎn)物的構(gòu)象復(fù)原等。

             (Recovery of target protein conformation)

    包涵體蛋白純化和復(fù)性的步驟

蛋白質(zhì)的復(fù)性是重組蛋白純化中最關(guān)鍵和最復(fù)雜的問題。蛋白質(zhì)的性質(zhì)不同，所處的環(huán)境不同，使其復(fù)性條件大不相同。任何一個(gè)蛋白質(zhì)都有一個(gè)最佳的復(fù)性條件，只有選擇到了合適的復(fù)性緩沖液，使蛋白得以正確折疊，才能使進(jìn)一步的層析分離得以順利完成。 

美迪西包涵體蛋白復(fù)性特點(diǎn)

活性蛋白的回收率高
正確的復(fù)性的產(chǎn)物易于與錯(cuò)誤的折疊蛋白質(zhì)分離。
折疊復(fù)性后應(yīng)得到濃度較高的蛋白質(zhì)產(chǎn)品
復(fù)性過程耗時(shí)少

復(fù)性常用方法

1、稀釋復(fù)性：直接加入水或復(fù)性緩沖液，缺點(diǎn)是體積增加較大，后續(xù)處理困難。
稀釋蛋白濃度：濃度高則容易形成聚集體（較低的復(fù)性收率）。有時(shí)需低于0.01mg/mL。
脈沖流加復(fù)性：分批次加入到緩沖液中，使折疊中間體保持在較低的水平。例：在5-10mg/mL終濃度下，溶菌酶復(fù)性收率可達(dá)80%以上。
2、透析復(fù)性：好處是不增加體積，通過逐漸降低外透液濃度來控制變性劑去除速度，速度慢，不適合大規(guī)模操作，無法應(yīng)用到生產(chǎn)規(guī)模。
3、超濾復(fù)性：選擇合適載留分子量的膜，允許變性劑通過膜而蛋白質(zhì)通不過。在生產(chǎn)中較多的使用，規(guī)模較大，缺點(diǎn)是不適合樣品量較少的情況，且有些蛋白可能在超濾過程中不可逆的變性（蛋白聚集于膜上）。
4、色譜復(fù)性：輔助手段，兼具分離。
4.1凝膠過濾復(fù)性：除了蛋白質(zhì)在膠粒中傳質(zhì)和擴(kuò)散外，蛋白質(zhì)與介質(zhì)之間并沒有發(fā)生其他作用。該法可以起到一定的抑制凝集作用，并且在凝膠過濾中脲等變性劑脫除得相對(duì)較慢，對(duì)有些蛋白質(zhì)的復(fù)性有利。
4.2吸附型層析復(fù)性：離子交換、疏水層析、親和層析和擴(kuò)張床層析均屬于吸附層析。其基本復(fù)性原理是層析柱平衡后，將變性蛋白上樣并吸附在凝膠介質(zhì)上，然后用清洗緩沖液洗掉未吸附的變性劑和雜蛋白，最后用復(fù)性緩沖液將吸附的蛋白洗脫下來，在洗脫過程中完成復(fù)性。
5、分子伴侶：主要包括硫氧還蛋白二硫鍵異構(gòu)酶、肽酰一輔氨酰順反異構(gòu)酶等。分子伴侶和折疊酶等不僅可在細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的折疊和聚集過程的平衡，而且可在體外促進(jìn)蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性。

    體內(nèi)復(fù)性主要是在工程菌培養(yǎng)過程中同時(shí)加入分子伴侶的基因進(jìn)行共表達(dá)；體外復(fù)性主要是將基因工程菌中包涵體溶解，再加入分子伴侶幫助折疊。

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