單細胞測序的重要性

隨著第二代測序(next generation sequencing，NGS) 技術(shù)和第三代測序( third generation sequencing，TGS)技術(shù)的飛速發(fā)展，引起生物研究領(lǐng)域的巨大變革。以前，需要從大量細胞中獲取足夠多的DNA 進行測序，因此測序結(jié)果是這些細胞“整體”的表征。然而，由于細胞異質(zhì)性，相同表型的細胞的遺傳信息可能存在顯著性差異，很多低豐度的信息會在整體表征中丟失。為了彌補傳統(tǒng)高通量測序的局限性，單細胞測序技術(shù)應(yīng)運而生。

單細胞測序技術(shù)是指在單個細胞水平上，對基因組、轉(zhuǎn)錄組、表觀組進行高通量測序分析的一項新技術(shù)。它能夠揭示單個細胞的基因結(jié)構(gòu)和基因表達狀態(tài)，反映細胞間的異質(zhì)性，在腫瘤、發(fā)育生物學(xué)、微生物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，正成為生命科學(xué)研究的焦點。2013年單細胞測序技術(shù)被Nature Methods評為年度技術(shù)（圖1左）。同年，《科學(xué)》雜志（Science）將單細胞測序列為年度最值得關(guān)注的六大領(lǐng)域榜首，認(rèn)為該技術(shù)將改變生物界和醫(yī)學(xué)界的許多領(lǐng)域。由于單細胞測序技術(shù)廣闊的應(yīng)用前景，2015年單細胞測序技術(shù)再度登上Science 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)封面（圖1右）。圖1.單細胞測序技術(shù)榮登頂尖雜志年度封面 (圖片來源http://t.cn/R840r7W；http://t.cn/RQHjnW3)

2017年10月16日，與“人類基因組計劃”相媲美的“人類細胞圖譜計劃”（圖3） 首批擬資助的38個項目正式公布。人類細胞圖譜計劃是一項大型國際合作項目：根據(jù)獨特的分子信息（如基因表達）對所有人類細胞種類進行定義，并將這些信息與傳統(tǒng)的細胞學(xué)表述（如位置和形態(tài)）相關(guān)聯(lián)。其中一項關(guān)鍵的技術(shù)就是單細胞測序。

相信未來單細胞技術(shù)，將會大大改變?nèi)祟惖目茖W(xué)研究以及臨床應(yīng)用，尤其是在腫瘤、微生物、神經(jīng)科學(xué)、免疫學(xué)等領(lǐng)域。下面我們將重點介紹近年來單細胞技術(shù)在以上領(lǐng)域的重要發(fā)現(xiàn)。

單細胞測序的應(yīng)用

1、 在腫瘤研究中的應(yīng)用

    2012年3月2日，深圳華大基因研究院在腫瘤研究上獲得突破性進展，于國際著名學(xué)術(shù)期刊《細胞》（Cell）上同時發(fā)表兩篇研究論文。該工作研發(fā)了一種解析單細胞基因組的新方法，并將該方法應(yīng)用于原發(fā)性血小板增多癥（一種血癌）和腎透明細胞癌（一種腎癌）（圖4）的腫瘤內(nèi)部遺傳特征研究。此新方法解決了之前無法解決的腫瘤高異質(zhì)性難題，為深入研究癌癥發(fā)生、發(fā)展機制及其診斷、治療提供了新的研究思路并開辟了新的研究方向。

圖3.華大單細胞測序技術(shù)分別應(yīng)用于血癌和腎癌研究

    2016年，麻省總醫(yī)院MGH、Broad研究所的研究人員在單細胞水平上對腦瘤進行基因組分析，首次在人類腦瘤樣本中鑒定到了癌癥干細胞及其分化后代 。研究人員分析了六個早期少突膠質(zhì)細胞瘤樣本的四千多個腫瘤細胞，發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞在發(fā)育上可以分為三類。其中一類比較像神經(jīng)干細胞，另外兩類具有一定的分化特征。研究結(jié)果證實了癌癥干細胞是少突膠質(zhì)細胞瘤的主要生長源，這些細胞將成為很有前景的治療靶標(biāo)。

    圖4:在單細胞水平上對腦瘤進行基因組分析

2、在微生物研究中的應(yīng)用

    單細胞測序在微生物領(lǐng)域也取得了重要突破。2017年，來自美國UCSF的研究組首次實現(xiàn)原核生物的微生物單細胞測序技術(shù)。圖5展示了該研究的詳細流程。

    圖5：基于微流控技術(shù)實現(xiàn)微生物單細胞測序

3、在神經(jīng)科學(xué)中的應(yīng)用

單細胞測序技術(shù)幫助科學(xué)家更深入的了解大腦神經(jīng)細胞。2017年，Salk生物研究所領(lǐng)導(dǎo)的團隊根據(jù)甲基化和調(diào)控特征，區(qū)分小鼠和人類大腦樣本中的神經(jīng)元亞型，并鑒定出人類額葉皮質(zhì)中一組新的神經(jīng)元。研究人員利用單細胞甲基化測序分析小鼠和人類額葉皮質(zhì)樣本中近6200個神經(jīng)元，并根據(jù)甲基化和調(diào)控元件特征對已知的神經(jīng)元亞型進行聚類。此外，他們還指出人類大腦中存在一種新的神經(jīng)元亞型，稱為“第6層興奮性神經(jīng)元”，它們有著獨特的甲基化標(biāo)記。

    這篇論文的通訊作者之一、Salk研究所的計算神經(jīng)生物學(xué)研究人員Margarita Behrens表示：“我們的研究表明，我們能夠根據(jù)神經(jīng)元的甲基化組來清晰定義神經(jīng)元類型。這有助于我們了解同一區(qū)域、外表相似的兩種神經(jīng)元為何表現(xiàn)不同?！?/p>

    圖6: 通過高通量單細胞甲基化測序得到小鼠和人額葉皮層神經(jīng)元細胞的亞型

2018年初，張鹍教授團隊在Nature Biotechnology上發(fā)表了一個基于全新單細胞核測序方法的成年人腦第二代單細胞圖譜。該研究通過結(jié)合基于微流體的單核測序（snDrop-seq）和單細胞轉(zhuǎn)座體超敏性位點測序（scTHS-seq）的方法，不僅能利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析鑒定不同功能的細胞類型，還能通過表觀遺傳學(xué)特征更好描述這些表達圖譜是如何調(diào)節(jié)或者維持的。該研究檢測了超過60，000個來自成人大腦皮層和小腦的單細胞，發(fā)現(xiàn)了35種不同的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞亞型。并且發(fā)現(xiàn)了這些細胞中哪些亞型更易受到不同腦部疾病常見危險因素的影響。

4、在免疫學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

由于傳統(tǒng)的免疫細胞分析方法，取樣來自一大堆細胞，低估了單個免疫細胞的多樣性，所以我們需要更加精確檢測單個免疫細胞的遺傳物質(zhì)，從而理解機體復(fù)雜的免疫機制。

2017年，Ido Amit團隊在大腦中發(fā)現(xiàn)一種新型免疫細胞——disease-associated microglia（DAM），證實DAM細胞負責(zé)降解死亡的細胞以及與阿爾茲海默癥相關(guān)聯(lián)的蛋白病斑。研究人員強調(diào)，只有對單個細胞進行RNA測序才能發(fā)現(xiàn)罕見的小膠質(zhì)細胞，從而為治療包括阿爾茲海默癥等在內(nèi)的神經(jīng)類疾病提供新方法。

    2017年，來自Broad研究所等機構(gòu)的科學(xué)家們借助單細胞基因組學(xué)技術(shù)在人類免疫系統(tǒng)中鑒定出了新型細胞。他們通過對健康獻血者分離獲得的約2400個單細胞RNA進行了測序，并富集HLA-DR+細胞系，嘗試 對DC細胞和單核細胞的分類進行重新鑒定和修訂。這一成果是人類細胞圖譜（Human Cell Atlas）計劃的首批重要發(fā)現(xiàn)之一。該計劃旨在描述人體內(nèi)的每一個細胞，以期加速生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展，將徹底改變醫(yī)生和研究人員如何理解、診斷和治療疾病。

    圖9.人類血液中樹突細胞和單核細胞圖譜

結(jié)語

單細胞測序技術(shù)從誕生至今，僅僅短短數(shù)年的時間，便取得了飛速的發(fā)展以及矚目的成果。2009年、2010年，在頂級期刊發(fā)表的單細胞測序技術(shù)類文章數(shù)均僅有3篇。而到2013年、2014年該數(shù)目分別為23及27篇?，F(xiàn)在單細胞測序技術(shù)越來越受到科研工作者及臨床工作者的青睞，每年有越來越多的重要成果發(fā)表在頂級期刊上。

而華大基因，在單細胞測序領(lǐng)域也取得了重大突破。2012-2017年，在單細胞測序領(lǐng)域華大基因一共發(fā)表了15篇文章，影響因子最高44，累計影響因子高達189。下面圖表是華大基因在單細胞測序領(lǐng)域的代表性文章：

    表1.華大單細胞測序高分文章列表