迄今為止本世紀(jì)已經(jīng)出現(xiàn)了三種冠狀病毒的全球流行。2002年11月在中國佛山報(bào)道了第一例人類感染嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥冠狀病毒（SARS-CoV）的病例，到2003年7月在全球27個(gè)國家中發(fā)現(xiàn)了8000多例SARS病例。SARS-CoV感染的主要癥狀是流感樣，包括發(fā)燒、頭痛、全身乏力、發(fā)抖和腹瀉。SARS大流行十年后，沙特阿拉伯一名男子被診斷出一種新的冠狀病毒，即中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV），由于受感染者的國際旅行，MERS-CoV已遍布全球。從2012年9月到2019年12月底，總共報(bào)告了2502例經(jīng)實(shí)驗(yàn)室確認(rèn)的MERS-CoV感染病例，包括858例相關(guān)死亡。

在2019年12月，COVID-19爆發(fā)，當(dāng)前的研究表明，這種冠狀病毒類似于SARS-CoV。盡管這三種冠狀病毒被確定對(duì)人類具有高致病性，但尚無有效的抗病毒治療方法。因此，當(dāng)前的研究集中在快速開發(fā)疫苗和抗病毒藥物以預(yù)防和治療新冠狀病毒感染。

目前最有吸引力的抗病毒藥物靶標(biāo)之一是SARS-CoV編碼的半胱氨酸蛋白酶-木瓜蛋白酶樣蛋白酶（PLpro），PLpro參與抑制細(xì)胞因子的產(chǎn)生和趨化因子，負(fù)責(zé)抗病毒感染，所以該酶是SARS-CoV抗病毒藥物設(shè)計(jì)中的重要分子靶標(biāo)。對(duì)CoV-2 PLpro底物特異性、結(jié)構(gòu)和機(jī)制的分子了解，將通過進(jìn)行合理的藥物靶向設(shè)計(jì)和研究來極大地促進(jìn)有效PLpro抑制劑的研發(fā)。

近日《Science》上發(fā)表了一篇最新研究，研究人員首先使用新穎的化學(xué)方法雜交組合底物庫對(duì)SARS-CoV-2 PLpro進(jìn)行了全面的活性分析，結(jié)果揭示了控制PLpro底物特異性的分子規(guī)則。利用這些信息，接下來設(shè)計(jì)了具有生化特性的有效抑制劑（VIR250和VIR251），與其他蛋白酶相比，它們對(duì)SARS-CoV-2 PLpro和相關(guān)SARSCoV-1 PLpro具有高選擇性。這項(xiàng)研究工作揭示了控制PLpro底物特異性的分子規(guī)律，并為開發(fā)具有潛在治療價(jià)值或藥物再利用的抑制劑提供了框架。

01

底物特異性概況

在P1位置的甘氨酸基側(cè)的肽鍵水解會(huì)導(dǎo)致nsp1、nsp2和nsp3蛋白的釋放，這對(duì)于病毒復(fù)制至關(guān)重要。SARS-CoV-2 PLpro還具有去泛素化和識(shí)別這些蛋白質(zhì)C末端的保守LRGG基序。先前僅針對(duì)包含天然氨基酸的組合底物庫對(duì)SARS-CoV-1 PLpro底物偏好進(jìn)行的研究，結(jié)果表明該蛋白酶識(shí)別P4-P1位置的LXGG基序，在P3位置具有廣泛的底物特異性。這些結(jié)果表明，對(duì)結(jié)合口袋結(jié)構(gòu)更詳細(xì)的作圖應(yīng)有助于新的活性底物的設(shè)計(jì)和用于抑制劑開發(fā)工作的最佳肽序列。為了實(shí)現(xiàn)這個(gè)目標(biāo)，研究人員開發(fā)了一個(gè)定義的組合底物庫（HyCoSuL），其中包含多種非蛋白原性氨基酸。

由于四肽熒光底物不能被具有去泛素化活性的酶有效地水解，因此研究人員設(shè)計(jì)并合成了具有Ac-LRXG-ACC和HyCoSuL的一般結(jié)構(gòu)的P2定義文庫。位置是固定的，一個(gè)位置包含19個(gè)氨基酸的等摩爾混合物。通過設(shè)計(jì)具有針對(duì)去泛素酶的定制肽支架的文庫，可以在分析過程中達(dá)到每個(gè)子庫中單個(gè)熒光底物的最高可能濃度。

P2文庫篩選顯示，SARS-CoV和SARS-CoV-2 PLpro在此位置具有很高的底物特異性，兩種蛋白酶在P3位置均表現(xiàn)出廣泛的底物偏好。SARS-CoV和SARS-CoV-2 PLpro的S3口袋不僅可以耐受帶正電的殘基，而且還可以耐受疏水性氨基酸。這些酶無法識(shí)別酸性殘基和大多數(shù)D-氨基酸。SARS-CoV和SARS-CoV-2 PLpro的S4口袋只能容納疏水性殘基，在天然氨基酸中，幾乎只能耐受亮氨酸。SARS-CoV PLpro在P4位置比亮氨酸更好地識(shí)別了兩個(gè)非蛋白殘基。

02

PLpro抑制劑的開發(fā)

為了進(jìn)一步分析具有非蛋白原性氨基酸的肽序列的選擇性，研究人員通過交換熒光將兩種底物轉(zhuǎn)化為抑制劑標(biāo)記一個(gè)反應(yīng)性基團(tuán)-乙烯基甲酯（VME）。選擇VME組是因?yàn)樗鼘?duì)DUB具有廣泛的反應(yīng)性，SARS-CoV PLpro和SARS-CoV-2 PLpro抑制劑的動(dòng)力學(xué)分析結(jié)果反映了底物水解的結(jié)果。與VIR250相比， VIR251對(duì)這些酶的抑制作用更強(qiáng)，但選擇性更低。兩種化合物均顯示出對(duì)SARS-PLpro變體的高選擇性，并能有效抑制SARS-CoV PLpro和SARS-CoV-2 PLpro活性。相反，實(shí)際上未觀察到對(duì)人DUB UCH-L3的抑制，而僅觀察到對(duì)MERS-PLpro的輕微抑制。此外，將HeLa裂解物與Ub-VME一起溫育可產(chǎn)生交聯(lián)曲線，這種交聯(lián)曲線不會(huì)因滴定VIR250或VIR251而改變。由于已知Ub-VME的主要交聯(lián)靶標(biāo)是人DUB酶，因此這些數(shù)據(jù)表明VIR250和VIR251不會(huì)與人DUB發(fā)生交叉反應(yīng)，這是尋找與人DUB具有最小交叉反應(yīng)性的選擇性抗病毒分子的重要發(fā)現(xiàn)。

接下來，研究人員著手確定SARS-CoV-2 PLpro與VIR250和VIR251的復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，以深入了解這些分子抑制SARS-CoV-2 PLpro活性的分子機(jī)理，以及觀察到的底物選擇性的基礎(chǔ)。大規(guī)模的交聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生了CoV-2 PLpro-VIR250和CoV-2 PLpro-VIR251配合物，其產(chǎn)率和純度足以滿足衍射質(zhì)量晶體的生長。

將載脂蛋白CoV-2 PLpro與CoV-2 PLpro / VIR250和CoV-2 PLpro / VIR251配合物進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)除β14-β15環(huán)位于活性位點(diǎn)附近并經(jīng)歷構(gòu)象變化外，總體結(jié)構(gòu)相似可能是由于抑制劑的結(jié)合。結(jié)構(gòu)分析表明，從CoV-2 PLpro的催化Cys 111側(cè)鏈投射出廣泛的電子密度，其中VIR250和VIR251的所有原子都可以明確地放置在其中。此外，Cys 111之間的共價(jià)鍵VIR250和VIR251都清晰可見。如預(yù)期的那樣，VIR250和VIR251抑制劑在活性位點(diǎn)附近均占據(jù)CoV-2 PLpro的S4-S1口袋并采用類似的結(jié)構(gòu)，P4位置是VIR250和VIR251之間唯一的化學(xué)差異區(qū)域，在VIR250中為Abu，在VIR251中為h Tyr。

03

VIR250和VIR251的分子識(shí)別

VIR250和VIR251的P3和P4位置的側(cè)鏈與CoV-2 PLpro的結(jié)合方式有重要區(qū)別。與VIR250中的Abu（Bth）相比，P4位置的hTyr向著S4口袋的另一側(cè)突出。β14-β15環(huán)（Asn 267、Tyr 268和Gln 269）向VIR251的hTyr轉(zhuǎn)移1.5-?，促進(jìn)了這種新的相互作用，從而促進(jìn)了許多新型的聯(lián)系，而這些聯(lián)系在沒有這種轉(zhuǎn)變的情況下是無法發(fā)生的。值得注意的是，與VIR250和VIR251接觸涉及的所有CoV-2 PLpro殘基在SARS CoV-1 PLpro中都完全保守，并且兩個(gè)SARS PLpro變體的總體結(jié)構(gòu)在酶的催化位點(diǎn)非常相似，這可能解釋了這些抑制劑具有靶向兩種酶的能力。

就上述觀察到的底物選擇性的相關(guān)性而言，P2對(duì)Gly的依賴性是來自CoV-2 PLpro的β14-β15和α5-α6環(huán)殘基的結(jié)果。對(duì)P3位置的正性和疏水性殘基偏愛以及對(duì)酸性殘基的選擇可能是其更寬泛的口袋和靠近Tyr 268、Gln 269和Leu 162的酸性羰基氧的結(jié)果。在P4位置上，對(duì)龐大的疏水殘基的強(qiáng)烈偏愛可以通過P4結(jié)合口袋的疏水特性來解釋，該特性主要由殘基Met 208、Pro 247、Pro 248、Tyr 264和Tyr 268形成。值得注意的是，SARS-CoV-2 PLpro的S4口袋的性質(zhì)已被VIR250和VIR251的P4處的Abu和h Tyr側(cè)鏈所利用。

04

CoV-1和CoV-2 PLpro處理Ub和Ubl變體

針對(duì)SARS-CoV-1 PLpro進(jìn)行的研究表明，該酶具有Ub結(jié)合域，可有效處理完整的Ub熒光底物，因此研究人員想看看SARS-CoV-2 PLpro是否也是如此。為此使用了基于Ub活性的探針（ABP）來標(biāo)記這兩種酶。研究人員觀察到生物素-Ub-VME對(duì)兩種蛋白酶都進(jìn)行了實(shí)質(zhì)性標(biāo)記，其濃度是酶濃度（200 nM）的兩倍。但是，與SARS-CoV-2 PLpro相比，SARS-CoV-1 PLpro的標(biāo)記效率更高。接下來通過測試其與一組Ub / Ubl ABP的反應(yīng)性來探索SARS-CoV-2 PLpro的Ub和Ubl蛋白底物特異性，該分析的結(jié)果表明SARS-CoV-2 PLpro更傾向于識(shí)別ISG15和monoUb，并且識(shí)別K48連接的和K63連接的diUb的能力較弱。

為了更徹底地檢查這些差異，研究人員對(duì)LRGG-ACC、Ub-ACC和ISG15-AMC熒光底物的SARS-CoV-1和CoV-2 PLpro加工動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SARS-CoV-2 PLpro處理Ub-ACC的效率是SARS-CoV-1 PLpro的四倍，并且SARS-CoV-2 PLpro處理ISG15-AMC的效率是Ub-ACC的60倍。此外，SARS-CoV-2 PLpro與SARS-CoV-1 PLpro一樣，與K63 tetraUb相比，對(duì)K48 tetraUb的處理更為穩(wěn)健。然而，在并排比較中，與SARS-CoV-1 PLpro相比，SARS-CoV-2 PLpro表現(xiàn)出顯著降低了處理K48 tetraUb的能力。

考慮到酶之間的非常高的總體相似性，與SARS-CoV-1 PLpro相比，SARS-CoV-2 PLpro處理K48 polyUb鏈的能力大大降低了。為了調(diào)和這種明顯的矛盾，研究人員將SARS-CoV-2 PLpro結(jié)構(gòu)與先前報(bào)道的SARS-CoV-1 PLpro結(jié)構(gòu)與K48 diUb配合使用。對(duì)SARS-CoV-1和2 PLpro催化位點(diǎn)的比較分析顯示，與S1 Ub、VIR250和VIR251的S4-S1位置接觸時(shí)所涉及的殘基100％保守，并且與預(yù)期結(jié)構(gòu)非常相似。盡管Ub S1位點(diǎn)比催化位點(diǎn)具有更大的變異性，但總體氨基酸保守性仍然很高，并且結(jié)構(gòu)在該區(qū)域排列得很好。

與SARS-CoV-1 PLpro的催化位點(diǎn)和S1 Ub位點(diǎn)相比，SARS-CoV-2 PLpro的S2 Ub位點(diǎn)在氨基酸水平上的保守性要低得多，并且在這些區(qū)域有一些結(jié)構(gòu)差異對(duì)于分子識(shí)別S2 Ub很重要。研究人員認(rèn)為SARS-CoV-2 PLpro處理K48 polyUb的能力下降的主要原因是在S2 Ub結(jié)合位點(diǎn)的差異，與此假設(shè)一致，SARS-CoV-1 PLpro亮氨酸75突變?yōu)榻z氨酸導(dǎo)致K48 diUb的結(jié)合減少了五倍，而對(duì)monoUb沒有明顯影響。結(jié)合SARS-CoV-2 PLpro中的其他變化，SARS-CoV-1和2 PLpro之間在S2結(jié)合位點(diǎn)出現(xiàn)了一些相對(duì)較小的變化，這些變化對(duì)它們處理K48 polyUb的能力的影響很大。

05

結(jié)果與討論

SARS-CoV-2 PLpro是抗病毒藥物開發(fā)的絕佳候選者，因?yàn)樗粌H阻斷病毒復(fù)制，而且還抑制感染細(xì)胞中信號(hào)級(jí)聯(lián)的失調(diào)。通過對(duì)藥物靶向的合理設(shè)計(jì)和研究，對(duì)SARS-CoV-2 PLpro底物特異性、結(jié)構(gòu)和機(jī)制的詳細(xì)理解將極大地促進(jìn)有效PLpro抑制劑的開發(fā)，這是此項(xiàng)研究的重點(diǎn)。

研究人員利用獲得的有關(guān)控制SARS-CoV-2 PLpro底物選擇性的分子規(guī)則的信息來開發(fā)共價(jià)抑制劑VIR250和VIR251。這些抑制劑被證明具有活性并選擇性抑制SARS-CoV-1和-2 PLpro，但對(duì)MERS-PLpro的活性卻弱得多，而對(duì)人DUB UCH-L3的活性則幾乎沒有。對(duì)于進(jìn)行針對(duì)該酶的肽類抗病毒化合物的研究，這是有價(jià)值的信息。VIR250和VIR251與SARS-CoV-2 PLpro配合使用的晶體結(jié)構(gòu)揭示了它們的抑制機(jī)制，并為觀察到的底物特異性譜提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

此外，出乎意料的發(fā)現(xiàn)是，VIR250和VIR251的P4氨基酸占據(jù)了SARS-CoV-2 PLpro寬S4口袋的相對(duì)側(cè)，并且該口袋中還有其他區(qū)域未被任一抑制劑所結(jié)合，這意味著未來的藥物開發(fā)工作旨在產(chǎn)生更多有效的抑制劑。對(duì)SARS-CoV-2-Mpro和SARS-CoV-2 PLpro底物特異性的比較分析表明，它們具有明顯不同的底物特異性，這表明對(duì)于肽類抑制劑，不可能設(shè)計(jì)出一種同時(shí)作用于兩種酶的抑制劑。但是，如果分別為這兩種蛋白酶找到了肽類抑制劑，那么有可能需要將它們用作混合物。另一種可能的方法是尋找可以同時(shí)抑制Mpro和PLpro的小分子抑制劑，這種抑制劑在COVID-19的治療中肯定會(huì)非常有益，但它可能與人半胱氨酸蛋白酶發(fā)生交叉反應(yīng)，從而可能導(dǎo)致不良副作用。

結(jié)構(gòu)分析顯示，SARS-CoV-2 PLpro的S2 Ub結(jié)合位點(diǎn)存在細(xì)微的結(jié)構(gòu)和序列變異，研究人員共同認(rèn)為這會(huì)削弱K48 polyUb的S2 Ub結(jié)合及隨后被加工的能力。此外，對(duì)Ub-ACC底物的酶動(dòng)力學(xué)分析表明，該酶可以有效地對(duì)其進(jìn)行處理，但是在SARS-CoV-1 PLpro的情況下，四肽底物和Ub之間的差異僅為10倍左右。這表明兩種酶之間在外位結(jié)合區(qū)相互作用的方面與氨基酸的同一性和相似性有些不同。鑒于Ub和ISG15偶聯(lián)在逃避宿主先天免疫反應(yīng)中的作用，SARS-CoV-1和-2 PLpro功能的這些有趣差異是否會(huì)對(duì)病毒生物學(xué)產(chǎn)生任何影響尚待觀察，并且將是未來研究的主題。

總的來說，此項(xiàng)研究工作揭示了控制PLpro底物特異性的分子規(guī)則，并揭示了底物結(jié)合口袋中SARS-CoV-1和-2 PLpro之間非常高的序列和結(jié)構(gòu)相似性。這些發(fā)現(xiàn)表明，先前發(fā)現(xiàn)的有關(guān)SARS-CoV-1 PLpro的信息可立即用于尋找有效的抗病毒分子，并重新靶向抑制SARS-CoV-2 PLpro的已知藥物。此外，與SARS-CoV-2 PLpro結(jié)合的新型抑制劑VIR250和VIR251的結(jié)構(gòu)為合理開發(fā)具有增強(qiáng)效價(jià)和ABP的抑制劑提供了框架。此項(xiàng)研究的譜圖和晶體學(xué)研究為開發(fā)性能改善的抑制劑開辟了新途徑，研究數(shù)據(jù)也為設(shè)計(jì)一種可以同時(shí)對(duì)抗SARS-CoV-1 PLpro和SARS-CoV-2 PLpro的全選擇性抑制劑提供了幫助。美迪西作為新藥研發(fā)CRO會(huì)持續(xù)關(guān)注此項(xiàng)研究進(jìn)展。